What？2010年就有乳铁蛋白抑制非典病毒的研究啦
节选自：北京协和医学院基础学院郎建社教授博士学位论文《乳铁蛋白抑制SARS冠状病毒感染宿主细胞的机理研究》
自从2002年11月在中国广东省爆发严重急性呼吸综合症（SARS)以来，人们对SARS的病原体，一种新型的冠状病毒，SARS冠状病毒（SARS-CoV)进行了详细的研究。本实验发现乳铁蛋白能够抑制 SARS 假病毒感染 293E-ACE2-Myc 细胞，这种抑制效应是剂量依赖的。在体外乳铁蛋白并不千扰Spike蛋白和ACE2受体的结合，而是通过结合细胞膜表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖抑制Spike蛋白和SARS假病毒结合到细胞上。HSPG是广泛分布于哺乳动物细胞表面的生物大分子。硫酸化修饰使HSPG携带大量的负电荷。乳铁蛋白分子表面的由碱性氨基酸构成的糖胺多糖结合区域以静电引力结合带有高度负电荷的HSPG。本实验发现肝素可以抑制SARS-假病毒感染 293E-ACE2-Myc细胞，这与以前肝素可以抑制SARS活病毒感染Vero E6细胞的结果是一致的。肝素是细胞表面硫酸乙酰肝素的竞争性抑制剂。很可能像其他病毒一样，HSPG在SARS-CoV进入细胞过程的发挥着重要的作用。
本实验结果表明，SARS-CoV很可能通过细胞表面HSPG的协助感染宿主细胞。当人体被 SARS-CoV 感染后，乳铁蛋白的表达水平上调的病理生理意义是：乳铁蛋白可以封闭细胞膜表面的 HSPG,从而抑制了SARS-CoV 感染宿主细胞，防止了SARS-CoV 在机体中更大范围的传播增殖。乳铁蛋白在SARS-CoV 感染人体的时候发挥着重要的保护机体的作用。
乳铁蛋白的结构与功能
当乳铁蛋白首次在乳汁中被发现的时候，它被命名为乳转铁蛋白，提示它和转铁蛋白在功能上的相似性。除了螯合铁离子之外，乳铁蛋白还有其他的功能。有实验表明乳铁蛋白具有杀菌，抗病毒，参与炎症反应，免疫调节，抑制肿瘤等多种功能。而这些现象背后的机制又不尽相同。下面我们着重讨论一下这个神奇蛋白的结构和功能之间的关系。
乳铁蛋白是转铁蛋白家族的成员，是一种能够结合和转运铁离子的糖蛋白。乳铁蛋白主要是外分泌腺体和中性粒细胞中特殊的颗粒释放出来的。中性粒细胞脱颗粒释放的乳铁蛋白是血液中乳铁蛋白的主要来源。乳铁蛋白主要存在于哺乳动物粘膜表面，如小肠粘膜，口腔粘膜，鼻粘膜，和泌尿系统等，以及乳汁及其他外分泌液中，如泪液、唾液、滑膜液，胆汁，胰腺分泌液，血液等。在泪液中乳铁蛋白的浓度可以高达2mg/ml。在血液中乳铁蛋白的正常浓度是1ug/ml,而在炎症状态下，乳铁蛋白的浓度可以升高到200ug/ml。中性粒细胞是人体内乳铁蛋白的重要来源，几乎所有的血液中的乳铁蛋白都是中性粒细胞脱颗粒释放出来的。这些都提示乳铁蛋白在先天性免疫反应中发挥着重要的保护作用。在几乎所有的炎症反应和一些病毒感染过程中，乳铁蛋白在体液中的浓度都会急剧增高，尤其是在炎症反应部位。有些学者已经把乳铁蛋白归为急性反应期蛋白。
乳铁蛋白的结构和生物学特性
乳铁蛋白是一种分子量80kDa的糖蛋白，对于铁离子具有高度亲和力。乳铁蛋白的分子结构在1984年被解析出来，由于在氨基酸序列上与血液中的转铁蛋白有60%的同源性，乳铁蛋白被归类为转铁蛋白家族的成员。乳铁蛋白由一条包含703个氨基酸的多肽链构成，这条多肽链折叠成的三级结构包含两个球形结构域，分别称作氨基端区域和羧基端区域。一段α螺旋结构连接着这两个球形结构域。每一个球形结构域又由两个亚结构域构成：C1,C2,N1,N2。每两个亚结构域形成的间隙就是结合铁离子的位点。乳铁蛋白的分子表面存在着糖基化位点，这些位点随着种属的不同而不同。乳铁蛋白一个显著的结构特征是，它是一个高度碱性的蛋白质，大量的正电荷分布在它的分子表面。
乳铁蛋白结合铁的能力是转铁蛋白的两倍，在有些情况下，转铁蛋白负责向乳铁蛋白提供铁离子。一个乳铁蛋白分子可以结合两个铁离子。尽管乳铁蛋白结合铁离子的能力非常强，甚至在酸性条件下也不受影响，它的整体饱和度却往往不超过10%。根据铁离子的饱和度，乳铁蛋白有三种存在形式：Apolactoferrin (iron free),monoferric form,hololactoferrin(bind two irons)。随着铁饱和度的不同，乳铁蛋白的三级结构也会有所不同。除了能够结合铁离子之外，乳铁蛋白还可以结合LPS、肝素、铝离子、锰离子、铜离子、钴离子、锌离子等。但是乳铁蛋白对于这些物质的亲和力要低得多。
乳铁蛋白和铁的代谢
尽管乳铁蛋白和转铁蛋白高度同源提示乳铁蛋白会影响铁离子在生物体内的分布，直到现在也没有证据表明乳铁蛋白在铁离子转运过程中发挥重要的作用。事实是，乳铁蛋白正常情况下在血液中的浓度是很低的，只有在感染和炎症的状态下乳铁蛋白的浓度才会上升。
乳铁蛋白的抗菌活性
铁离子是细菌生存所必需的，乳铁蛋白对铁离子有很高的亲和力，能够从细菌生活的环境中整合铁离子，从而抑制了细菌的生长繁殖。很长一段时间人们认为这是乳铁蛋白抑菌的唯一原因，因为一些研究显示只有apolactoferrin 具有抑菌活性，而且这种抑菌活性随着乳铁蛋白铁饱和程度的提高而降低。乳铁蛋白在酸性环境下保持结合铁离子的能力具有重要的意义。在感染和发炎的部位，由于微生物的代谢活动，局部的pH值可能低于4。5。在这样的环境下，乳铁蛋白仍可以结合从转铁蛋白释放的铁离子，从而阻止了微生物利用繁殖所必需的铁离子。后来发现乳铁蛋白可以通过一种非依赖鳌合铁的机制杀死链球菌（Streptococcus mutans)。乳铁蛋白的这种活性被认为是通过直接与细菌表面结合发挥作用的。对乳铁蛋白的品体结构研究发现在蛋白表面存在大面积的正电荷区域。乳铁蛋白的这些区域很容易通过静电引力与葛兰氏阴性菌带负电的LPS结合。这种相互作用可以引起细菌细胞膜损伤，改变细胞膜的通透性，导致LPS 从细胞壁上释放。乳铁蛋白引起细菌细胞壁的这些改变使得细菌对于溶菌酶和抗生素更加敏感。
乳铁蛋白的抑制病毒活性
乳铁蛋白有着广泛的生物学功能，但是这些功能又好像与它结合铁的能力无关。乳铁蛋白可以结合某些DNA和RNA病毒受体,从而抑制病毒进入宿主细胞。这些病毒包括辛德毕斯甲病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、塞姆利基森林甲病毒、人类多瘤病毒、人类乳头瘤病毒、乙型脑炎病毒、艾柯病毒、人类免疫缺陷病毒、轮状病毒等。但是，它抑制病毒的主要机制是乳铁蛋白能够结合细胞表面的HSPG，在细胞表面形成局部高浓度的乳铁蛋白保护层。越来越多的研究结果表明，很多病毒利用HSPG作为宿主细胞表面上的最初锚定点。通过这种方式，乳铁蛋白在早期阶段抑制病毒进入细胞。乳铁蛋白的氨基末端的糖胺多糖结合区域以很高的亲和力结合硫酸乙酰肝素,有效的阻止了HSV病毒进入宿主细胞。许多研究表明乳铁蛋白具有抗病毒活性，其主要作用特点有：①主要作用于感染早期或是病毒粘附阶段，其抗病毒作用与其干扰病毒与细胞的接触有关;②天然完整的、折叠方式正确的乳铁蛋白具有较好的抑制病毒作用;③乳铁蛋白的抗病毒作用与其结合铁等金属的能力无关;④牛乳铁蛋白的抗病毒能力较人乳铁蛋白为强；⑤病毒抑制作用随乳铁蛋白浓度的增加而增强。
乳铁蛋白与炎症反应
乳铁蛋白通过鳌合铁离子和与靶细胞相互作用从正负两个方面调节免疫反应。一方面，乳铁蛋白促进免疫细胞的增殖和分化，激活免疫反应。另一方面，乳铁蛋白又发挥着抗炎症反应因子的角色。由于它的抑菌作用和结合细菌细胞壁上LPS的能力，乳铁蛋白可以抑制炎症反应的发展和由炎症细胞因子和活性氧引起的组织损伤。铁离子是活性氧产生过程中重要的催化剂。乳铁蛋白整合铁离子可以减少活性氧的产生和由此引起的组织损伤。
乳铁蛋白与免疫反应
乳铁蛋白具有调节先天免疫反应和获得性免疫反应的生物学功能。乳铁蛋白可以刺激未成熟的T细胞前体分化成有功能的成熟的免疫细胞。口服乳铁蛋白能够提高肿脏淋巴细胞分泌IFN-Y和IL-12的能力。乳铁蛋白还可以通过提高肠道IFN-Y,IL-12和NOD2基因表达水平来刺激整个机体的免疫水平。在机体发生病原微生物感染的情况下，乳铁蛋白从中性粒细胞中释放出来，结合于单核细胞和巨噬细胞上，促进炎性因子的分泌，如IFN-Y,IL-6,GM-CSF等。同时乳铁蛋白的结合能够增强巨噬细胞吞噬病原微生物的能力。